本网讯（生环学院 于红梅）近期，我院高层次引进人才赵娜老师在一区TOP期刊Advanced Science（IF：16.806）发表题为“Targeting RNA with Next‐ and Third‐Generation Sequencing Improves Pathogen Identification in Clinical Samples”的研究论文。中科院微生物所王军研究员为该论文的通讯作者，南方医科大学周宏伟教授、解放军总医院解立新主任为共同通讯作者。

本世纪以来，在全球范围内SARS、多次不同亚型禽流感和MERS疫情的暴发，以及目前尚在世界范围内大流行的新冠病毒感染频发。新现传染病不仅影响到物种保护和生物多样性维持，还严重威胁全人类生命健康及生态安全。传统的临床病原鉴定主要以培养和生化检测为主，不仅受限于靶向性、基于预测性、有偏检测以及耗时长等特征，而且无法涵盖多种病原混合感染及新现/再现病原，给临床诊断和治疗带来了沉重负担。测序技术的发展使得无偏好得对宿主/环境样本进行序列鉴定成为可能，尤其是针对混合感染（细菌、真菌、病毒、寄生虫）或者未知病原鉴定上有绝对优势。以Pacbio和Nanopore单分子测序（ONT）为代表的三代测序技术的兴起不仅在测序读长上为我们提供很大优势，而且ONT测序还具有文库快速制备、便携、DNA/RNA直接测序、实时测序和数据分析的优势，能够为新现未知病原的发现争取到宝贵的时间。然而针对宿主含量高的体液样本而言，不同测序平台的不同测序方案效果往往存在差异，准确选择契合的的测序方案尤为重要。

随着下一代测序技术的不断进步，宏基因组测序（mNGS）极大的提高了病原检测的效率，并有助于识别新现/再现传染病以及难以培养的病原微生物；此外，通过测序识别抗生素抗性（ARG）微生物也为改善治疗方案提供了依据。但mNGS在临床应用方面仍面临诸多困难，主要有三个方面：1）微量样本；2）宿主信息干扰；3）无法直接检测RNA病原。mNGS主要针对病原微生物的DNA，并使用二代测序技术产生较短的序列，因此会忽略一些以RNA为主要遗传物质的病原微生物。即使目前基于RNA的分析或宏转录组的研究相对较少，但都表明靶向RNA的检测能有效揭示功能活跃的病原微生物/基因；此外，虽然细菌基因组只有几个rDNA拷贝，但rRNA分子含量在活跃细胞中却是极高的，理论上，靶向RNA可以避免占优势但处在休眠的微生物占测序读数的比例。以ONT测序技术为代表的三代测序拥有快速制备文库及超长读长等优势，能有效提高临床样本中病原的检测。与此同时，ONT直接RNA测序技术也为临床样本中RNA病原无偏的检测提供了可能。

图1 技术示意图

面对这些存在问题与技术发展，中国科学院微生物研究所王军团队与解放军总医院第一医学中心、南方医科大珠江医学院和北京大学第三医院合作，收集了宿主信息含量较高的临床肺泡灌洗液（BALF）、脑脊液（CSF）和血液（Blood）样本，建立了RNA/cDNA靶向测序（mtNGS），以减少临床样本中的宿主核苷酸比例，并通过与牛津纳米孔技术（ONT）相结合（mtTGS）以提高测序时间。研究表明，与mNGS相比，mtNGS提高了微生物的检测比例，促进了细菌病原的鉴定，并能对真菌、病毒和抗生素抗性基因（ARG）进行检测，均有更好的覆盖度。此外，基于ONT的mtTGS由于其较长的读长优势进一步提高了病原微生物的鉴定，也加快了诊断的时间。同时，利用ONT的直接RNA测序和靶向测序的测试结果均表明，ONT具有重要的病原检测潜力，但仍需进一步发展。因此，这项研究表明RNA基础上的临床病原诊断准确度、覆盖度和效率更高，有更高的应用潜力，特别是当与ONT的发展与技术更新相结合时。

该研究得到了国家自然科学基金、科技部重点研发计划课题等项目的经费支持。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202102593